G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors，GPCR）是高等真核生物中廣泛存在的感知和傳感實(shí)體，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)利用GPCR的顯著傳感能力以及真核微生物釀酒酵母的遺傳特性來(lái)構(gòu)建生物傳感器可用于化學(xué)物質(zhì)、細(xì)菌、病毒和疾病的檢測(cè)，并且因其成本和便攜等特性，可應(yīng)用到多種不同釀酒酵母生物傳感器開(kāi)發(fā)中。然而對(duì)于生物傳感器的性能而言，靈敏且可靠的輸出至關(guān)重要，尤其是對(duì)于目標(biāo)分析物可能以痕量濃度存在的低成本應(yīng)用。因此，迫切需要一種廣泛適用的策略來(lái)提高基于酵母GPCR的生物傳感器的檢測(cè)限和信號(hào)輸出，以滿(mǎn)足實(shí)際使用的要求

近日，廈門(mén)大學(xué)袁吉鋒教授團(tuán)隊(duì)在Biosensors and Bioelectronics雜志上發(fā)表了一篇題為“Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens"的研究論文。該論文在釀酒酵母中將GPCR信號(hào)通路與半乳糖調(diào)節(jié) (GAL) 系統(tǒng)耦合，并實(shí)施正反饋環(huán)路以增強(qiáng)酵母生物傳感器在真菌檢測(cè)方面的性能。證明了級(jí)聯(lián)放大電路可以顯著改善工程化酵母生物傳感器，具有更好的靈敏度和信號(hào)輸出幅度，這將為它們?cè)诠残l(wèi)生領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用鋪平道路。

研究人員前期在釀酒酵母中利用GPCR 信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)重塑具有不同表達(dá)譜的酵母半乳糖調(diào)節(jié)子，展示了基于GPCR系統(tǒng)的可塑遺傳裝置可能為未來(lái)的代謝工程和生物傳感器應(yīng)用帶來(lái)巨大的希望。而GPCR系統(tǒng)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，已被廣泛用作酵母的傳感元件生物傳感器開(kāi)發(fā)。因此研究人員在前期研究基礎(chǔ)上通過(guò)人工轉(zhuǎn)錄因子（synthetic transcription factor，sTF）將GPCR信號(hào)通路與半乳糖調(diào)節(jié)（GAL）系統(tǒng)連接起來(lái)（Cell Reports Methods, 2023, 3, 100647），引入了正反饋回路進(jìn)一步增強(qiáng)酵母?jìng)鞲衅鞯男阅埽瑥亩_(kāi)發(fā)模塊化酵母生物傳感器，可低成本、靈敏且快速地檢測(cè)病原真菌。

首先，GPCR信號(hào)機(jī)制本質(zhì)上是可模塊化的，研究人員基于前期工作半乳糖調(diào)節(jié) (GAL) 系統(tǒng)通過(guò)人工轉(zhuǎn)錄因子與信息素感知的 GPCR 信號(hào)通路耦合，重塑了MAPK控制的轉(zhuǎn)錄因子，將輸出模塊重定位為半乳糖系統(tǒng)。通過(guò)使用來(lái)自病原真菌白色念珠菌的異源GPCR取代酵母天然Ste2受體調(diào)整GPCR蛋白的輸入模塊，重構(gòu)的酵母生物傳感器可感知來(lái)自病原真菌的外來(lái)信息素并觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以誘導(dǎo)GAL系統(tǒng)下報(bào)告基因的表達(dá)（圖1）。

級(jí)聯(lián)放大在傳感器設(shè)計(jì)中可實(shí)現(xiàn)感知信號(hào)放大以及輸出信號(hào)的增強(qiáng)，因此研究人員在工程化酵母生物傳感器中引入一個(gè)額外的正反饋回路來(lái)增強(qiáng)靈敏度和信號(hào)輸出。具體的是，設(shè)計(jì)了一種正反饋放大器，即可自響應(yīng)的GAL系統(tǒng)控制下的Gal4表達(dá)盒組成（圖2）。感知真菌信息素后，傳感器系統(tǒng)除了控制報(bào)告基因的sTF之外，還包含額外的轉(zhuǎn)錄放大層，sTF 驅(qū)動(dòng)Gal4轉(zhuǎn)錄激活劑的轉(zhuǎn)錄，從而進(jìn)一步放大源自sTF的信號(hào)，以提高生物傳感器的靈敏度和輸出幅度。為了評(píng)估級(jí)聯(lián)放大生物傳感器的性能，使用不同梯度濃度的病原真菌白色念珠菌的信息素對(duì)其進(jìn)行了測(cè)試，在同步敲除釀酒酵母GPCR系統(tǒng)的負(fù)反饋因子Sst2之后，級(jí)聯(lián)放大生物傳感器可具備靈敏的檢測(cè)性能，相比于初始傳感器，檢測(cè)限（LOD）提升了4000倍（從1 nM提升至0.25 pM），半有效濃度（EC50）提升了9700倍（從32.55 nM到3.323 pM）（圖3），此外，信號(hào)級(jí)聯(lián)的設(shè)計(jì)延長(zhǎng)了劑量持續(xù)時(shí)間，即使在低劑量的信息素刺激下也能產(chǎn)生持續(xù)且顯著的信號(hào)輸出。且利用傳感器信號(hào)感知-信號(hào)輸出關(guān)系可進(jìn)行信息素的定量分析。

此外，為了進(jìn)一步確定傳感器的性能，研究人員還嘗試探究溫度、pH以及迭代培養(yǎng)對(duì)傳感器的性能影響，結(jié)果表明，基于GPCR的釀酒酵母?jìng)鞲衅骶哂忻黠@的穩(wěn)定性以及精確性（圖3）同時(shí)為了滿(mǎn)足未來(lái)的傳感器實(shí)際應(yīng)用，研究人員采用比色測(cè)定而不是依賴(lài)熒光信號(hào)來(lái)設(shè)計(jì)視覺(jué)輸出模塊，結(jié)果表明工程化酵母生物傳感器可以通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大來(lái)檢測(cè)真菌信息素，并產(chǎn)生肉眼可以捕獲的強(qiáng)烈信號(hào)輸出。

總之，這項(xiàng)研究成功地利用酵母中的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大器來(lái)增強(qiáng)生物傳感器在檢測(cè)限、動(dòng)態(tài)范圍和輸出幅度方面的性能。級(jí)聯(lián)信號(hào)放大使工程化酵母生物傳感器能夠在病原體檢測(cè)中提供更好的靈敏度和良好的可靠性。未來(lái)信號(hào)受體通過(guò)多個(gè)級(jí)聯(lián)信號(hào)放大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號(hào)輸出模塊的組合優(yōu)化將最終實(shí)現(xiàn)眾多具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的生物傳感器開(kāi)發(fā)。

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